作者:   發(fā)布時(shí)間:2014/6/27 10:36:05   瀏覽次數(shù):2254

一種鑒別氨基酸的新型陣列傳感器

氨基酸是生物代謝過程中的重要物質(zhì)，是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料。氨基酸的快速識(shí)別對(duì)細(xì)胞代謝分析具有重要意義。目前，氨基酸檢測(cè)分析方法有氣相色譜( GC)、液相色譜( HPLC)和毛細(xì)管電泳(CE)等各種色譜法。這些方法雖然具有精確度高和檢出限低的優(yōu)點(diǎn)，但這些檢測(cè)方法均需要借助大型儀器，同時(shí)樣品前處理時(shí)間長(zhǎng)，不利于樣本的快速檢測(cè)。受到哺乳動(dòng)物味覺系統(tǒng)的啟發(fā)，一種新型的檢測(cè)分析技術(shù)近年來受到重視，即基于交叉響應(yīng)原理的陣列傳感器。目前，對(duì)于此類傳感器的研究已經(jīng)有相關(guān)報(bào)導(dǎo)，識(shí)別對(duì)象包括金屬離子，有機(jī)小分子，肽類等。其識(shí)別原理如圖1所示．該傳感器由多個(gè)傳感點(diǎn)構(gòu)成，每個(gè)傳感點(diǎn)對(duì)于分析對(duì)象呈現(xiàn)不同的響應(yīng)度，綜合所有傳感點(diǎn)的信息構(gòu)成了分析對(duì)象的識(shí)別圖譜，從而區(qū)分和檢測(cè)分析對(duì)象。傳感點(diǎn)不必具有特異性，只需對(duì)于不同的分析對(duì)象有不同作用力，從而產(chǎn)生了針對(duì)分析物的識(shí)別模式。該研究構(gòu)建了鑒別氨基酸的液體陣列傳感器，對(duì)9種常見的氨基酸進(jìn)行了識(shí)別，對(duì)氨基酸類化合物的快速識(shí)別進(jìn)行了探索研究。
1試驗(yàn)部分
1.1試劑與儀器
9種氨基酸：谷氨酰胺( Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)，均為分析純，購(gòu)自Sigma - Aldrich公司。
7種染料：溴甲酚紫、溴酚紅、亮黃、甲基紫、吖啶橙、間胺黃和孔雀綠，均為分析純，購(gòu)自Sipna - Aldrich公司。四磺酸基四苯基卟啉(TPPS4)（純度為99%），購(gòu)自美國(guó)FrontierScienti6c公司。
超純水由MiUipore Direct-Q Water system（法國(guó)Molsheim公司）制備。Imark酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。
l.2試驗(yàn)過程
1 2.1試驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備
試驗(yàn)以9種氨基酸為檢測(cè)對(duì)象，包括谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、纈氨酸以及甲硫氨酸。9種氨基酸分別用超純水定容至50mL，濃度均為375umol/L，備用。
1.2.2陣列構(gòu)建與檢測(cè)方法
液體陣列構(gòu)建時(shí)，選用的傳感物質(zhì)不需進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)，但為了保證其交叉響應(yīng)的特性和光譜信號(hào)的實(shí)現(xiàn)，傳感物質(zhì)的選擇需要考慮以下2個(gè)方面：
(l)傳感物質(zhì)具有多個(gè)作用位點(diǎn)，易與分析物發(fā)生相互作用；
(2)具有生色基團(tuán)，當(dāng)傳感物質(zhì)與分析物進(jìn)行結(jié)合時(shí)，會(huì)引起光譜變化。
該傳感器構(gòu)建前期進(jìn)行了大量光譜學(xué)研究，經(jīng)過試驗(yàn)篩選出7種染料與1種卟啉化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與測(cè)定波長(zhǎng)如圖2所示。該傳感器構(gòu)建在96孔板上，其布局如圖3所示。一列的8個(gè)孔構(gòu)成一個(gè)陣列，相當(dāng)于一個(gè)傳感器。1塊96孔板則相當(dāng)于含有12個(gè)傳感器，可以同時(shí)對(duì)12個(gè)樣本進(jìn)行分析。檢測(cè)前，向每列的8個(gè)孔中分別加入1OO uL對(duì)應(yīng)的傳感物質(zhì)S1-S8。分析檢測(cè)時(shí)，向此8孔中同時(shí)加入1OOuL的分析樣本，20℃下振蕩10min，測(cè)定對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的OD值。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)平行樣測(cè)定，每個(gè)平行樣的檢測(cè)結(jié)果包含了8個(gè)光譜數(shù)據(jù)，所有樣該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組成了一個(gè)(9×3) x8維的矩陣，將這些原始光譜數(shù)據(jù)作為輸入變量進(jìn)行模式識(shí)別分析。

一種鑒別氨基酸的新型陣列傳感器
2結(jié)果與討論
2.1聚類分析
聚類分析（Hierarchical clusLer analysis，HCA）是一種常用的統(tǒng)計(jì)分析方法。利用聚類分析，由聚類圖可以直觀地判斷所采用的液體陣列傳感方法對(duì)于9種氨基酸的區(qū)分能力，同時(shí)聚類圖還表示了不同類別氨基酸的相似程度。用歐氏距離定義樣品之間的相似度，用組間連接來定義集群。利用SPSS軟件對(duì)27次試驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA分析，結(jié)果如圖4所示。在HCA圖上，9種氨基酸被完全分開，由此可見，所構(gòu)建的液體傳感陣列對(duì)于氨基酸具有強(qiáng)大的識(shí)別能力。由圖4可見，當(dāng)歐式距離為25時(shí)，9種氨基酸可以分成兩大簇，其中賴氨酸和組氨酸形成一簇，而其他的7種氨基酸為一簇。從理化性質(zhì)上分析，賴氨酸與組氨酸均為堿性氨基酸，且均為極性帶正電氨基酸。而谷氨酸與這兩種氨基酸的歐式距離最遠(yuǎn)，是因?yàn)楣劝彼釣樗嵝园被幔覟闃O性帶負(fù)電氨基酸。而纈氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸與絲氨酸形成一簇，這5種氨基酸分子均含有一個(gè)羧基和一個(gè)氨基，在酸堿度上表現(xiàn)為中性氨基酸。同時(shí)，分析這5種氨基酸的極性發(fā)現(xiàn)，纈氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸均為非極性氨基酸，而甘氨酸和絲氨酸雖然為極性氨基酸，但是這2種氨基酸均為極性不帶電氨基酸。分析HCA圖可知，9種氨基酸的區(qū)分主要是基于氨基酸之間的酸堿度與極性的不同，追溯到陣列構(gòu)建上，傳感陣列對(duì)于分析物酸堿度和極性的識(shí)別能力主要來源于所選擇的敏感物質(zhì)中包括了酸堿指示劑和極性指示劑。另外，卟啉等物質(zhì)對(duì)于不同功能基團(tuán)具有很好的識(shí)別效果，這可能也是陣列能夠?qū)λ釅A度和極性相近的氨基酸進(jìn)行區(qū)別的一個(gè)重要原因。
2.2 LDA判別分析
判別分析是在分類確定的條件下，根掘某一研究對(duì)象的各種特征值判別其類型歸屬問題的一種多變量統(tǒng)計(jì)分析方法。它按照一定的判別準(zhǔn)則，建立—個(gè)或多個(gè)判別函數(shù)，用研究對(duì)象的大量資料確定判別函數(shù)中的待定系數(shù)，并計(jì)算判別指標(biāo)。根據(jù)建立的判別函數(shù)判斷未知樣本的類型歸屬。利用判別分析可以從液體陣列上的反應(yīng)指紋信息中提取2個(gè)或3個(gè)包含綜合信息的函數(shù)，將這幾個(gè)函數(shù)作為坐標(biāo)就可以將指紋信息可視化為一張散點(diǎn)圖（圖5）。每個(gè)判別分析散點(diǎn)圖上的點(diǎn)都代表了—個(gè)分析樣品與陣列反應(yīng)的識(shí)別結(jié)果：聚在一起表明這些點(diǎn)所代表的分析樣品與陣列的識(shí)別反應(yīng)模式相近，反之，點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)則表明這些點(diǎn)所代表的分析樣品與陣列的識(shí)別反應(yīng)模式差別大。

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